그램에 따라 염색하는 방법

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단계
파트 1/3: 샘플 준비
파트 2/3: 그람 염색 수행
3/3부: 결과 확인
팁
경고
뭐가 필요하세요
추가 기사

그람 염색은 샘플에서 박테리아의 존재를 확인하고 그람 양성 또는 그람 음성으로 구별할 수 있는 신속한 검사 방법입니다. 이 방법은 세포벽의 화학적 및 물리적 특성을 기반으로 합니다. 그람 방법은 거의 항상 세균 감염 진단의 첫 번째 단계로 사용됩니다.

이 방법은 유사한 증상을 가진 세균 감염을 구별하는 방법으로 1882년에 이 방법을 개발하고 1884년에 출판한 덴마크 과학자 G.K. Gram에 의해 제안되었습니다. 연쇄상 구균에 의한 폐렴 (폐렴구균) 및 클렙시엘라 뉴모니아.

단계

파트 1/3: 샘플 준비

1 갈 준비를 하세요. 샘플이 오염되지 않도록 장갑을 착용하고 긴 머리를 묶습니다. 흄 후드 또는 기타 통풍이 잘되는 작업 영역을 선택하고 소독하십시오. 작업을 시작하기 전에 분젠 버너와 광학 현미경이 제대로 작동하는지 확인하십시오.
2 슬라이드를 소독합니다. 슬라이드가 충분히 깨끗하지 않으면 비누와 물로 씻어서 기름기와 먼지를 제거하십시오. 그런 다음 에탄올, 유리 세정제 또는 실험실에서 허용되는 다른 방법으로 소독하십시오.
3 유리 슬라이드에 샘플을 놓습니다. 그람 염색을 통해 의료 샘플의 개별 박테리아 또는 페트리 접시의 박테리아 배양을 볼 수 있습니다. 먼저 유리 슬라이드에 바르십시오. 얇은 조사된 액체의 층. 시간이 지남에 따라 박테리아의 세포벽이 손상되고 그람 염색에 대한 반응을 예측하기 어려워지기 때문에 샘플을 24시간 이상 보관하지 않는 것이 좋습니다.
- 조직 샘플을 검사하는 경우 슬라이드에 1-2방울을 적용합니다. 다른 깨끗한 슬라이드의 가장자리를 사용하여 슬라이드 위에 얇은 층으로 액체를 바르십시오. 샘플이 마를 때까지 기다리십시오.
- 페트리 접시에서 박테리아를 염색하는 경우 분젠 버너 화염에서 박테리아 루프가 빛나기 시작할 때까지 살균한 다음 식히십시오. 루프가 있는 유리에 멸균수 한 방울을 놓고 루프를 다시 멸균하고 식힌 다음 작은 세균 배양 샘플을 부드럽게 잡고 물에 녹입니다.
- 배양 배지의 박테리아는 먼저 볼텍스 믹서에서 혼합되어야 하며, 그 다음 샘플은 물을 추가하지 않고 유리 슬라이드에 루프로 옮겨야 합니다.
- 도말을 검사하는 경우 슬라이드에 가볍게 누릅니다.
4 샘플을 수정합니다. 열의 영향으로 박테리아가 유리에 달라 붙고 얼룩이져도 씻겨 나가지 않습니다. 유리 슬라이드를 버너 불꽃 위로 빠르게 2~3회 통과시키거나 전기 히터로 가열합니다. 샘플을 변경하지 않도록 슬라이드를 과열하지 마십시오. 분젠 버너를 사용하는 경우 불꽃이 작고 키가 큰 주황색 기둥이 아닌 파란색 원뿔처럼 보이는지 확인하십시오.
- 메탄올로 약물을 고칠 수 있습니다. 건조된 샘플에 메틸 알코올 1-2방울을 떨어뜨리고 과도한 알코올을 배출하고 슬라이드를 공기 건조합니다. 이 방법은 연구 중인 세포를 덜 손상시키고 더 깨끗한 배경을 제공한다는 사실 때문에 바람직합니다.
5 슬라이드를 염색 트레이에 놓습니다. 이 트레이는 샘플을 지지할 수 있는 미세한 메쉬가 있는 얕은 금속, 유리 또는 플라스틱 접시입니다. 페인팅에 사용된 액체가 트레이로 흐르도록 준비된 유리를 그리드에 놓습니다.
- 염색 쟁반이 없으면 플라스틱 얼음 쟁반 위에 슬라이드를 놓을 수 있습니다.

파트 2/3: 그람 염색 수행

1 샘플에 크리스탈 바이올렛(크리스탈 바이올렛) 용액을 바릅니다. 크리스탈 바이올렛(종종 젠티안 바이올렛이라고도 함) 용액을 피펫에 넣고 준비물에 몇 방울 떨어뜨립니다. 30-60초 동안 기다립니다.크리스탈 바이올렛(CP)은 물에서 해리되어 CP + 및 염소(Cl-) 이온을 형성합니다. 이 이온은 그람 양성 세포와 그람 음성 세포의 세포벽과 막을 관통합니다. CF + 이온은 박테리아 세포의 음전하 성분과 상호 작용하여 보라색으로 염색합니다.
- 많은 실험실에서 후커의 크리스탈 바이올렛을 사용합니다. 이 변형에는 침전을 방지하는 암모늄 옥살레이트가 포함됩니다.
2 물로 부드럽게 염료를 헹굽니다. 슬라이드를 기울이고 세척 병에서 증류수 또는 수돗물을 부드럽게 그 위에 바릅니다. 물이 그 위로 약간만 흐르도록 조제물에서 물줄기를 멀리 향하게 하십시오. 너무 많은 압력을 가하면 그람 양성균을 씻어낼 수 있으므로 주의하십시오.
3 샘플에 요오드를 바르고 헹굽니다. 피펫을 사용하여 샘플을 요오드로 덮습니다. 요오드를 60초 이상 그대로 두었다가 이전에 염료를 씻어낸 것처럼 물로 부드럽게 헹굽니다. 음으로 하전 된 이온 형태의 요오드는 CF + 이온과 상호 작용하여 결과적으로 크리스탈 바이올렛과 요오드의 큰 복합체가 세포의 외부 및 내부 층에 형성됩니다. 이것은 세포에 갇힌 크리스탈 바이올렛에 의해 고정됩니다.
- 요오드는 부식성입니다. 요오드와 피부 접촉을 피하고 삼키거나 증기를 흡입하지 마십시오.
4 표백제를 넣고 즉시 헹굽니다. 보통 아세톤과 에탄올의 혼합물은 1:1 비율로 사용하며 시간은 잘 지켜주셔야 합니다. 슬라이드를 비스듬히 놓고 떨어지는 액체가 보라색을 잃고 투명해질 때까지 슬라이드에 탈색제를 추가합니다. 특히 탈색 용액에 아세톤이 많이 포함된 경우 일반적으로 10초 미만이 소요됩니다. 제 시간에 멈추지 않으면 용액이 그람 양성 세포와 그람 음성 세포 모두에서 염료를 씻어낼 수 있으므로 염색 절차를 반복해야 합니다. 이전에 염료로 했던 것처럼 남아 있는 탈색 용액을 즉시 씻어냅니다.
- 순수(95% 이상) 아세톤도 탈색제로 사용할 수 있습니다. 탈색 용액에 아세톤이 많을수록 탈색이 더 빨리 일어나므로 더 높은 정밀도가 필요합니다.
- 시간이 지남에 따라 추측하기 어렵다면 탈색 용액을 한 번에 한 방울씩 추가하십시오.
5 샘플에 대조 염료를 바르고 물로 헹굽니다. 일반적으로 사프라닌 또는 푹신으로 사용되는 조영제는 무색(그람 음성) 박테리아를 분홍색 또는 빨간색으로 염색하기 때문에 그람 양성 세포와 그람 음성 세포 사이에 추가적인 조영제를 얻을 수 있습니다. 조영제를 샘플에 45초 이상 그대로 둔 다음 물로 헹굽니다.
- 푹신은 많은 그람 음성 박테리아(예: 혈우병 그리고 레지오넬라균) 더 강렬한 색상. 이러한 점에서 초보자에게 사용하는 것이 좋습니다.
6 슬라이드를 말리십시오. 공기 중에 그대로 두거나 여과지로 닦을 수 있습니다. 그러면 Gram 염색이 완료됩니다.

3/3부: 결과 확인

1 광학 현미경을 준비합니다. 무대에 표본 슬라이드를 놓습니다. 박테리아는 크기가 매우 다양하므로 400x에서 1000x로 확대해야 할 수도 있습니다. 1000x 배율에서 더 나은 대비를 위해 오일 침지 렌즈를 사용하는 것이 좋습니다. 슬라이드가 움직이지 않도록 주의하면서 슬라이드에 침지 오일 한 방울을 바르십시오. 그렇지 않으면 오일에 기포가 형성될 수 있습니다. 그런 다음 현미경 터렛을 사용하여 필요한 대물렌즈가 오일에 닿도록 정렬합니다.
- 유침법은 건식렌즈가 아닌 특수렌즈에만 적용됩니다.
2 그람 양성균과 그람 음성균을 식별합니다. 광학 현미경으로 슬라이드를 검사합니다.그람 양성 박테리아는 크리스탈 바이올렛이 두꺼운 세포벽 내부에 있기 때문에 보라색으로 착색됩니다. 그람 음성 박테리아는 크리스탈 바이올렛이 얇은 세포벽을 통해 세척된 후 분홍색 대조 염료가 침투하기 때문에 분홍색 또는 빨간색이어야 합니다.
- 샘플이 너무 두꺼우면 가양성이 발생할 수 있습니다. 모든 유형의 박테리아가 그람 양성으로 나타나면 다른 샘플을 염색하여 정확한 결과를 확인하십시오.
- 샘플이 탈색 용액에 너무 오래 노출되면 위음성 결과가 발생할 수 있습니다. 모든 박테리아가 실제로 그람 음성인지 확인하기 위해 다른 샘플을 염색합니다.
3 결과를 참조 이미지와 비교하십시오. 어떤 박테리아가 보이는지 확실하지 않은 경우 박테리아 모양 및 그람 염색 결과별로 정렬된 참조 이미지 세트를 확인하십시오. National Microbial Pathogen Database, Bacteria in Photos 및 기타 여러 사이트에서 유사한 세트를 온라인으로 찾을 수 있습니다. 다음은 박테리아를 식별하는 데 도움이 되는 가장 일반적이거나 진단적인 예입니다.
4 그람양성균을 모양으로 구별한다. 세균의 종류는 현미경의 모양으로 식별할 수 있습니다. 흔히 구균(둥근)과 간균(막대 모양)입니다. 다음은 그람 양성(보라색) 박테리아의 일반적인 형태입니다.
- 그람 양성 구균 - 원칙적으로는 포도상구균 (포도 다발 형태로) 또는 연쇄상 구균 (형태 사슬).
- 그람 양성 스틱 포함하다 간균, 클로스트리디아, 코리네박테리아 그리고 리스테리아... 속의 대표자 방선균 종종 가지와 스레드가 있습니다.
5 그람 음성균 알아보기. 종종 그람 음성(분홍색) 박테리아는 구균(둥근), 막대 모양(길고 가늘음) 및 중간 모양의 구균의 세 그룹으로 나뉩니다.
- 그람 음성 구균 다양한 유형으로 가장 자주 표현 나이세리아.
- 그람 음성 스틱 포함하다 대장균, 장내세균, 클렙시엘라, 시트로박테리움, 세라티아, 프로테우스, 살모넬라균, 시겔라, 슈도모나스 그리고 많은 다른 사람들. 콜레라 비브리오 또한 일반 또는 곡선 스틱의 형태일 수 있습니다.
- 그람 음성 "구균" 간균(또는 "구균") 포함하다 보르데텔라, 브루셀라, 혈우병 그리고 파스퇴렐라.
6 혼합된 결과를 평가합니다. 일부 박테리아는 세포벽이 약하거나 지방으로 덮여 있기 때문에 명확한 염색을 하지 않습니다. 이러한 박테리아는 동일한 세포 내에서 보라색과 분홍색을 동시에 염색하거나 동일한 종의 세포가 동일한 도말에서 다르게 염색될 수 있습니다. 이 문제는 24시간 이상 노출된 모든 박테리아 샘플에서 발생할 수 있지만 일부 박테리아는 샘플의 신선도와 상관없이 이에 취약합니다. 이 경우 세균을 정확하게 식별하기 위해서는 Ziehl-Nielsen 염색, 배양 성장 관찰, TSI(triple iron sugar) 검사, 유전자 검사와 같은 보다 전문적인 방법이 필요할 수 있습니다.
- 방선균, 관절박테리움, 코리네박테리아, 마이코박테리아 그리고 프로피온 박테리아 그람 양성으로 간주되지만 종종 그람 염색이 모호한 결과를 초래합니다.
- 등의 작고 미세한 세균 트레포네마, 클라미디아 그리고 리케차, Gram에 따라 염색하기 어렵습니다.
7 사용한 재료는 버리십시오. 폐기물 처리 절차는 특정 실험실과 사용되는 재료에 따라 다릅니다. 일반적으로 염색 트레이의 액체는 위험한 물질로 간주되어 꼭 맞는 병에 붓습니다.사용한 슬라이드는 10% 표백제 용액에 담근 후 용기에 담아 바늘과 의료폐기물을 수거하여 폐기합니다.

팁

그람 염색 결과는 샘플의 품질에 따라 크게 좌우된다는 점을 기억하십시오. 환자는 분석을 위한 좋은 샘플(예: 단순 타액이 아닌 깊은 기침에서 나오는 가래)을 얻을 수 있도록 훈련을 받아야 합니다.
변색되면 에틸 알코올이 아세톤보다 느리게 작용합니다.
실험실에서 작업할 때는 표준 안전 예방 조치를 따르십시오.
샘플에는 그람 양성균과 그람 음성균이 모두 포함되어 있어야 하므로 연습을 위해 면봉을 사용하십시오. 한 가지 유형의 박테리아만 관찰되는 경우 이는 샘플을 탈색 용액으로 충분하지 않거나 너무 많이 처리했음을 의미할 가능성이 큽니다.
슬라이드는 나무 빨래집게로 찍을 수 있습니다.